• 说明书丨HRX1082+Annexin+V-FITCPI+Apoptosis+Detection+Kit细胞凋亡检测试剂盒.docx

产品信息

产品描述

Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒是用FITC标记的Annexin V作为探针，来检测细胞早期凋亡的发生。

其检测原理为：在正常的活细胞中，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在早期凋亡的细胞中，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36 kDa的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合，可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。

另外，本试剂盒中还提供了碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）用来区分存活的早期细胞和坏死或晚期凋亡细胞。PI是一种核酸染料，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但可以透过凋亡晚期和坏死细胞的细胞膜而使细胞核染红。因此，将Annexin V与PI联合使用时，PI 则被排除在活细胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡细胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被FITC 和PI 结合染色呈现双阳性（Annexin V+/PI+）。

本试剂盒可用于流式细胞仪、荧光显微镜进行检测。

产品组分

运输与保存方法

冰袋（wet ice）运输。-20 ℃避光长期保存，避免反复冻融，一年有效。

【注】：如果需要在短时间内多次重复使用，可以在4 ℃避光保存，半年有效。

注意事项

1）由于细胞凋亡是一个快速的过程，建议样品在染色后1小时之内进行分析。

2） 对于贴壁细胞，消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞，需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。处理贴壁细胞时要小心操作，尽量避免人为的损伤。胰酶消化时间过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的损伤；PI摄入过多，消化时间过长，细胞膜同样易造成损伤，甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-FITC的结合。消化时将胰酶铺满孔板底后，轻摇使胰酶与细胞充分接触，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余少量胰酶再消化一段时间，待细胞间空隙增大，瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中尽量不用EDTA，EDTA会影响Annexin V与PS的结合。

3） 实验中如需要固定细胞，比如在检测凋亡的同时检测细胞周期，只能选用Annexin V-FITC，而不能选用Annexin V-EGFP，因为在固定过程中EGFP会变性导致丧失激发荧光的能力。固定前需要先将细胞与Annexin V-FITC进行孵育，并用Binding buffer洗掉未结合的Annexin V-FITC。因为固定过程中细胞通透性增加会产生细胞碎片，可以和Annexin V结合，对结果产生干扰。

4）如果样品来源于血液，请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS，能与Annexin V结合，从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并在200 g离心洗去血小板。

5）试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。

6）Annexin V-FITC和PI是光敏物质，在操作时请注意避光。

7）本产品仅作科研用途！

操作方法

1.1 样品染色

1）悬浮细胞：800 g离心力，4℃离心5 min收集细胞。

贴壁细胞：用不含EDTA的胰酶消化后，800 g，4℃离心5 min收集细胞。胰酶消化时间不宜过长，以防引起假阳性。

2）用预冷的PBS洗涤细胞2次，每次均需800 g，4℃离心5 min。收集1～5×10⁵细胞。

3）吸弃PBS，加入100 μL Binding Buffer重悬细胞。

4）加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI Staining Solution，轻轻混匀。

5）避光、室温反应5-10 min。

6）样品在1小时内用流式细胞仪或者荧光显微镜观察和检测。

【注】：为了避免洗涤细胞时损失细胞，在吸液时可以用大的Tip头套上小的Tip头吸液。

7）流式细胞仪分析

1. 用流式细胞仪检测，Annexin V-FITC(Ex=488 nm, Em=530 nm) 的绿色荧光通过FITC 通道（ FL1）检测；PI 红色荧光(Ex=488nm,Em≥630nm)通过 PI 通道（FL2 或 FL3）检测，建议使用 FL3。

2.荧光补偿调节：使用经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。

8）显微镜分析：

1.滴一滴用Annexin V-FITC/PI双染的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞。

【注】：对于贴壁细胞，可直接用盖玻片培养细胞并诱导细胞凋亡。

2.在荧光显微镜下用双色滤光片观察。Annexin V-FITC荧光信号呈绿色，PI荧光信号呈红色。