产品信息

产品描述

      His标签蛋白纯化琼脂糖凝胶是由高度交联的4%琼脂糖凝胶为基质，用于纯化各种表达系统融合表达的His重组蛋白。

储存条件

在2-8℃稳定保存，保质期两年。

使用说明

1.   准备buffer

平衡缓冲液：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，用NaOH 调pH为8.0

洗涤液: 50mM NaH2PO4，300 mM NaCl，10 mM咪唑，用NaOH 调pH 为8.0

洗脱缓冲液：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，250 mM 咪唑，用NaOH 调pH 为8.0

所用水和Buffer在使用之前建议用0.22μm 或0.45μm滤膜过滤。减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。

2.   样品准备

以大肠杆菌表达系统为例

1). 4℃离心30 分钟（4000 g）收集菌体，弃上清。

2). 用冷平衡缓冲液重悬细胞, 如果需要，可加入适量的添加剂，如蛋白酶抑制剂（PMSF）或其他蛋白酶抑制剂等。

注意：加入的抑制剂不能对Ni-IDA 亲和层析介质的性能有影响，破碎液中不能含有EDTA、EGTA 等螯合剂，DTT、巯基乙醇等还原剂，尿素、盐酸胍等变性剂。

3). 用超声波破碎法在冰上破碎菌体，直到样品破碎完全。

可选：如果裂解物太粘稠，可以加入RNase A （终浓度10 μg/ml） 和DNase I （终浓度5 μg/ml） 并在冰上孵育10-15分钟。

4) 4℃离心20分钟（12,000 g），除菌过滤，并小心将上清和沉淀分离。

5).用SDS-PAGE 分析His融合蛋白的含量及可溶性。

3.纯化重组His融合蛋白

1). 轻轻重悬His琼脂糖凝胶。

2). 吸取适量的His琼脂糖凝胶至重力柱中,用5-10 倍柱体积的冷平衡缓冲液平衡His琼脂糖凝胶。

3). 将制备好的含有His 融合蛋白澄清菌液加入到层析柱中，流速控制为0.5-1 ml/min，

4). 裂解菌液全部流出层析柱后就立刻加入洗涤液清洗层析柱，所需量大约为柱体积的10-20 倍或者直到流出液的A280 值达到最低且稳定；

5). 用5-10 倍柱体积的洗脱缓冲液以0.5-1ml/分钟的流速洗脱，收集洗脱液。或者根据流出液A280 值判断，当数值陡然上升时开始接收洗脱液，直到A280 数值降至最低且稳定停止收集。根据目的蛋白的性质和用途选择透析到20 mMTris-HCl，pH 8.0 或者1 ×PBS，pH 7.4 中。

4.树脂再生及储存

His标签蛋白纯化产品可以重复使用而无需再生，但随着使用次多较多，非特异性结合的蛋白增多和蛋白的聚集，往往造成流速和结合载量都下降，这时需要对树脂进行清洗。

按照下面操作流程进行镍离子剥离和重新挂镍离子。

1) 使用 5 倍柱体积去离子水清洗填料；

2) 使用 5 倍柱体积 100 mMEDTA (pH 8.0)剥落镍离子；

3) 使用 10 倍柱体积去离子水清洗填料；

4) 使用5 倍柱体积0.5M NaOH 清洗，

5) 使用 10 倍柱体积去离子水清洗填料；

6) 使用 3-5 倍柱体积 100 mMNiSO4 再生挂镍；

7) 使用 10 倍柱体积去离子水清洗；

填料再生后，可以立即使用，如不立即使用，需要将填料悬浮于等体积的 20%乙醇中，置于 2-8°C 保存。

注意事项

1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2）本产品仅作科研用途！

3）微球使用前应充分振荡均匀。

4）微球应保存在储存溶液中，防止干燥。

5） 请勿将微球冷冻或离心，以免引起不可逆聚集。